Next-generation optogenetic tools : sodium, proton outward and inward pumps

  • Optogenetische Werkzeuge der nächsten Generation : Natrium-, Protonen-Pumpen nach außen und innen

Shevchenko, Vitaly; Gordeliy, Valentin (Thesis advisor); Bamberg, Ernst (Thesis advisor); Engelhard, Martin (Thesis advisor); Bueldt, Georg (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Lichtgetriebene Protonen- und Chloridpumpen wurden als Proteine entdeckt, die von halophilen Archaeen zur phototrophen Energieerzeugung verwendet werden. Einige Jahrzehnte später wurde ein lichtgesteuerter Kationenkanal beschrieben. Seine funktionellen Eigenschaften waren geeignet, um depolarisierende Ströme in Nervenzellen zu induzieren, die bei Beleuchtung zu deren Aktivierung führen. Das war der Beginn der Optogenetik. 5 Jahre später wird die Optogenetik 2010 zur „Methode des Jahres“ gekürt. Und jetzt, 10 Jahre nach diesem Moment, wurde die Optogenetik zu einem sich schnell entwickelnden und erweiternden Werkzeug in den Neurowissenschaften und darüber hinaus. Ausgehend von einem Toolkit mit drei funktional unterschiedlichen Proteinen (Familie der Bakteriorhodopsin-ähnlichen Protonenpumpen, die Chloridpumpe Halorhodopsin und der Kationentransporter Channelrhodopsin 2) erfordert die Optogenetik neue und optimierte Tools. Dies führte zu einer rationalen Mutagenese bekannter Proteine, um die Pumprate, das spektrale Absorptionsoptimum und die Erholung nach kontinuierlicher Beleuchtung zu beeinflussen. Die Verwendung verfügbarer Werkzeuge ließ einige Bedenken aufkommen, wie Protonenpumpen den pH-Wert um die beleuchteten Zellen herum verändern und daher die Regulationsproteine unnötig aktivieren könnten; oder es kann eine genauere Steuerung der Anzahl der transportierten Ionen erwünscht sein, nicht nur um eine Pore zu öffnen. Neue Genomsequenzierungstechnologien führten zur Metagenomik, der Analyse des genetischen Inhalts einer Probe aus der Wildnis. Es stellte sich heraus, dass Rhodopsine, lichtgetriebene Ionentransporter / -sensoren, unter allen Taxa weit verbreitet sind. Mittlerweile sind rund 30 verschiedene Hauptgruppen (Clades) identifiziert. Vertreter einiger Klassen werden als Kandidaten für optogenetische Anwendungen ausgewählt. Sie werden jetzt als "optogenetische Werkzeuge der nächsten Generation" bezeichnet. Die vorliegende Arbeit handelt von drei Rhodopsinklassen, die vielversprechende Kandidaten für das erweiterte optogenetische Toolkit sind. Diese Arbeit beruft sich auf Daten aus dem Jahr 2015.Der erste entdeckte Vertreter des Natriumpumpen-Rhodopsins Dokdonia eikasta KR2 ist funktional charakterisiert. Nach der Lösung der Kristallstruktur* wurde erfolgreich eine rationale Mutagenese durchgeführt, um ein Protein zu konstruieren, das beim Beleuchten Kaliumionen pumpt. Die Charakterisierung der Mutante umfasste Funktionstests zum Pumpen in Escherichia coli-Suspensionen und elektrophysiologische Messungen an schwarzen Doppelschicht-Lipidmembranen. Die Bedeutung der Untersuchung von Natrium pumpenden Rhodopsinen und von technischen Kaliumpumpen ist hoch. Diese Ionen sind bei der Aktivierung von Nervenzellen natürlich, d.h. genau diese Ionen werden von Neuronen zum Feuern verwendet. Das zweite Rhodopsin in der vorliegenden Arbeit ist Rhodopsin MacR, eine sehr kleine Protonenpumpe und Proteorhodopsin-Homolog, aus dem ultra-kleinen Actinobacterium Candidatus actinomarina minuta. Optogenetische Anwendungen mit MacR waren von begrenztem Erfolg, jedoch zeigte das Protein extreme Kristallisierbarkeit, was ein Beugungsmuster hoher Ordnung ergab (die Kristallstruktur* wurde bei 1,4 Å gelöst). Schließlich wurde ein Mitglied der Xenorhodopsin-Gruppe aus Nanosalina XeR umfassend charakterisiert. Obwohl Xenorhodopsine ein Homolog zu einem sensorischen Rhodopsin sind, scheinen sie Proteinpumpen zu sein, die Protonen nach innen pumpen. NsXeR wurde umfassend charakterisiert, beginnend mit der Identifizierung des Zielgens durch funktionelle und spektroskopische Charakterisierung, gefolgt von elektrophysiologischen Messungen in HEK293- und NG108-Zellen. Die Fähigkeit von XeR zur Aktivierung von Neuronen wurde auch bei hohen Frequenzen (50 Hz) nachgewiesen. Die Kristallstruktur von NsXeR* wird in der vorliegenden Arbeit ebenfalls beschrieben. Die wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit werden in hochrangigen Fachzeitschriften veröffentlicht:•Crystal structure of light-driven sodium pump in Nature Structural and Molecular Biology, 2015•Inward H+ pump xenorhodopsin: Mechanism and alternative optogenetic approach in Science Advances, 2017•Fast iodide-SAD phasing for high-throughput membrane protein structure determination in Science Advances, 2017 Zusammenfassend führte die vorliegende Arbeit dazu, dass dem optogenetischen Toolkit neue vielversprechende Rhodopsine hinzugefügt wurden.

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