New structural insights in chloroplast F1FO-ATP synthases

Vlasov, Alexey; Gordeliy, Valentin (Thesis advisor); Dencher, Norbert (Thesis advisor); Bamberg, Ernst (Thesis advisor); Engelhard, Martin (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2020

Kurzfassung

ATP-Synthase ist ein Enzym, das die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP) katalysiert - dem Molekül, das Energie für lebenswichtige biochemische Reaktionen in fast allen lebenden Organismen liefert. ATP-Synthasen vom F-Typ sind in Bakterienzellmembranen, Thylakoidmembranen von Chloroplasten und Mitochondrien-Innenmembranen von Eukaryoten verbreitet. Die ATP-Synthase vom F-Typ ist ein Membranproteinkomplex mit einem großen Nichtmembranteil F1 und einem Membranteil FO. ATP-Synthasen sind in verschiedenen Spezies so weit verbreitet, dass sie konservierte Teile erhalten haben, die für ihre Hauptfunktionen verantwortlich sind: ATP-Synthese/Hydrolyse und Transmembranionentransport in F1- bzw. FO-Regionen. Gleichzeitig sind ihre Organisation und Zusammensetzung der Untereinheiten sehr variabel, insbesondere für mitochondriale ATP-Synthase-Dimere vom F-Typ in Eukaryoten (vier verschiedene Typen wurden bisher gefunden). Bakterielle ATP-Synthasen liegen im monomeren Zustand vor. Chloroplasten-ATP-Synthasen sind ebenfalls überwiegend Monomere, es gibt jedoch Dimere und Oligomere laut Literatur. Derzeit liegt die physiologische Rolle solcher Oligomere wird diskutiert. Einer der wichtigsten und unbekanntesten Teile von ATP-Synthasen ist die eine Membran-FO-Region, insbesondere ein rotierender Teil (cn-Ring), der aus n Kopien von Protomeren (c1-Untereinheiten) besteht, die in einem Kreis angeordnet sind. In Verbindung mit der a-Untereinheit ermöglicht der c-Ring einen Transmembranionentransport, dreht die γ-Untereinheit und treibt die ATP-Synthese an. Trotz der Tatsache, dass die ATP-Synthase in den letzten Jahrzehnten im Mittelpunkt des Interesses stand und in ihren strukturellen und funktionellen Studien ein enormer Fortschritt erzielt wurde, blieben einige wichtige Details unbekannt. Die hochauflösenden Strukturen (besser als 3 Å) wurden für c-Ringe aus bakteriellen und mitochondrialen ATP-Synthasen erhalten, die Wissenslücke bestand jedoch für den c-Ring aus Chloroplasten, z.B. Schlüsseldeterminanten der c-Ring-Stöchiometrie waren unbekannt. Eine weitere offene Frage betrifft die molekulare Zusammensetzung der inneren Pore von c-Ringen. Die Literaturdaten zeigten mindestens vier verschiedene Arten von Interaktionsschnittstellen von c-Ringen im Zusammenhang mit zusammengesetzten ATP-Synthase-Dimeren in Mitochondrien von Eukaryoten. In all diesen Fällen sind zusätzliche Untereinheiten, die mit einem c-Ring außer a- und γ-Untereinheiten interagieren, ebenfalls an der Dimerisierungs-FO/FO-Schnittstelle zwischen zwei Monomeren der ATP-Synthase beteiligt. Im Fall von monomeren Bakterien- und Chloroplasten-ATP-Synthasen wurde im FO-Teil jedoch keine zusätzliche Maschinerie gefunden, die eine ähnliche Stabilisierung eines c-Rings bewirken könnte. Die Frage der molekularen Zusammensetzung der inneren Pore von C-Ringen aus verschiedenen Organismen, z.B. Bakterien und Chloroplasten wurde in der Literatur nicht ausführlich diskutiert. In der Literatur wurde gezeigt, dass Pigmente, z.B. Chlorophyll a und Beta-Carotin eng mit einem c-Ring aus Spinat-Chloroplasten verbunden sind und könnten in Verbindungen mit einem postulierten Lipid-Pfropfen in seiner inneren Pore sein. Aufgrund des Fehlens einer c-Ring-Struktur konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, dass die Pigmente sich im c-Ringkanal befanden. In der vorliegenden Arbeit wurde die hochauflösende Struktur (2,3 Å) eines c-Rings der ATP-Synthase vom F-Typ aus Spinatchloroplasten erhalten. Dies ist die erste hochauflösende Struktur eines c-Rings aus pflanzlichen Chloroplasten und die ersten Untereinheiten einer ATP-Synthase, die mit der Meso-Methode kristallisiert wurden. Die vorliegende Arbeit füllt die Wissenslücken über c-Ringe aus pflanzlichen Chloroplasten und bietet eine vollständige c1/c1-Interaktionsschnittstelle, die durch ein Netz von Wasserstoffbrücken zwischen Aminosäuren benachbarter Protomere gebildet wird. Die Rolle der Motive G(A,S)xxxG(A,S) wurde in der Literatur theoretisch als Schlüsselfaktoren der C-Ring-Stöchiometrie in verschiedenen Organismen vorhergesagt. In meiner Arbeit wird direkt gezeigt, dass die Motive G(A,S)xxxG(A,S) nur teilweise an einem Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen an der c1/c1-Schnittstelle beteiligt sind. Es wurde auch gezeigt, dass das vollständige Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen der Motive G(A,S)xxxG(A,S) enthält und anderer Aminosäuren, die die c1/c1-Schnittstelle und damit eine Stöchiometrie des c-Rings bestimmen.Ich fand zusätzliche positive Elektronendichten im c-Ring. Sie waren nicht mit den c-Untereinheiten assoziiert. Ich fand ähnliche Dichten während der Analyse hochauflösender Strukturen in der Literatur von c-Ringen aus verschiedenen Organismen, z.B. Bakterien und Mitochondrien von Eukaryoten. Sie wurde bisher in der Literatur nicht diskutiert. Die Abstände zwischen polaren/unpolaren Schnittstellen wurden berechnet und zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen der inneren Pore und der Außenseite des c-Rings. Die hydrophobe Länge innerhalb des c-Rings war ~ 1,4-mal größer als in der Membrandoppelschicht außerhalb des c-Rings. Ein ähnlicher Unterschied (~ 1,2 – 1,4-fach) wurde für alle c-Ringe von Literaturdaten mit verfügbaren hochauflösenden Strukturen gefunden. Unsere Hypothese ist, dass Isoprenoidchinone in der inneren Pore von c-Ringen unsere und Literaturdaten erklären können. Wir schlage vor, dass diese Moleküle in allen c-Ringen vorhanden sind (z. B. Plastochinon-9 (PQ-9) in einem c-Ring aus Spinatchloroplasten, Menachinonen in Bakterien, Ubichinonen in Mitochondrien von Eukaryoten).Ich habe die Hypothese getestet durch UV-Vis-Differentialspektroskopie der c-Ring-Proben unter Verwendung einer qualitativen Reaktion der Reduktion von Ketonen und Aldehyden zu Alkoholen durch NaBH4 und zeigten das Vorhandensein von Verbindungen mit einer Chinongruppe ähnlich Trimethylbenzochinon - einer polaren Einheit von PQ-9. Dies liefert, obwohl indirekt, Argumente für die Hypothese, dass Isoprenoidchinone universelle Cofaktoren von ATP-Synthasen sein könnten, die das Austreten von Ionen durch einen c-Ring verhindern und diesen stabilisieren. Zusätzlich untersuchte ich die Struktur der gesamten ATP-Synthase. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) von gereinigter intakter ATP-Synthase aus Spinat-Chloroplasten, rekonstituiert in POPC/MSP1E3D1-Nanoplatten durchgeführt. Die Struktur mit niedriger Auflösung hat einen ähnlichen Formfaktor wie die V-förmigen Dimere mitochondrialer ATP-Synthasen. Sie wirft Fragen nach einer möglichen physiologischen Rolle solcher Oligomere von Chloroplasten-ATP-Synthasen auf. Das Verständnis der ATP-Synthase im Detail ist äußerst wichtig. Die ATP-Synthase ist Teil von oxidativen und Photophosphorylierungssystemen, und relevante Studien zeigen verborgene Verbindungen der ATP-Synthase in verschiedenen biochemischen Prozessen auf. Funktionsstörungen dieses Enzyms führen zu einer Reihe schwerer Krankheiten, z. B. Diabetes, schwere Stoffwechsel- und Mitochondrienstörungen, Funktionsstörungen von Geweben und Organen, neurodegenerative und altersbedingte Erkrankungen. Gleichzeitig könnte die ATP-Synthase aufgrund ihrer signifikanten Detailvariabilität in Organismen aus entfernten Abstammungslinien ein Ziel für das strukturbasierte Design neuer antibakterieller Arzneimittel werden. Daher sind neue Erkenntnisse über seine strukturellen und funktionellen Merkmale für die Pharmakologie und angewandte Medizin, für die Entwicklung verschiedener Therapien und das strukturbasierte Wirkstoffdesign sowie für die Grundlagenbiologie wichtig. Ich glaube, dass unsere Arbeit zu einem besseren Verständnis dieser molekularen Maschine beiträgt.

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