Structural investigations of the light-driven sodium-pumping rhodopsin KR2

Kovalev, Kirill; Gordeliy, Valentin (Thesis advisor); Büldt, Georg (Thesis advisor); Bamberg, Ernst (Thesis advisor); Engelhard, Martin (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2020

Kurzfassung

Der Ionentransport durch die Zellmembran ist ein grundlegender biologischer Prozess. Es ermöglicht den Zellen, eine richtige innere Zusammensetzung aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus erzeugt es ein elektrochemisches Potential an der Membran, das für viele wesentliche Prozesse wie ATP-Synthese, Nährstoffaufnahme usw. verwendet wird. Die Ionentranslokation wird von speziellen Proteinen durchgeführt - Ionentransportern, die den aktiven oder passiven Transfer verschiedener Arten von Ionen antreiben können die Lipidmembran. Eine der größten und vielfältigsten Familien solcher Proteine ist die Familie der mikrobiellen Rhodopsine (MRs). MRs sind lichtempfindliche Membranproteine (MPs), die ein retinales Chromophor als prothetische Gruppe umfassen. Die meisten MRs sind lichtgetriebene Ionentransporter; Sie können jedoch andere wichtige biologische Funktionen erfüllen, z. B. Photosensoren, Enzyme usw.Der erste gefundene MR war ein lichtgetriebenes H+-Pump Bakteriorhodopsin aus dem Archäon Halobacterium salinarum (HsBR). Es ist derzeit das am meisten untersuchte MR und dient als Modellprotein für alle MRs und MPs im Allgemeinen. Die Entdeckung von Channelrhodopsinen (ChRs) in der Chlorophytenalge Chlamydomonas reinhardtii (CrChR1 und CrChR2) wurde zu einem Fundament der Optogenetik - einer Technik zur Kontrolle von lebendem Gewebe durch Licht. Optogenetik verwendet MRs zur optischen Kontrolle von Zellen und Geweben mit beispielloser zeitlicher und räumlicher Auflösung. Die Entwicklung der Optogenetik führte zusammen mit der Entwicklung der funktionellen Metagenomik zu zahlreichen großen Erkenntnissen auf dem Gebiet der Rhodopsine. In 2010 wurden viele neuartige MRs mit einzigartigen Eigenschaften entdeckt und funktionell und strukturell charakterisiert. Unter ihnen befanden sich lichtgetriebene Na+-Pumpen (NaRs). Die Existenz von NaRs in der Natur war zweifelhaft, da alle MRs eine protonierte positiv geladene Schiff-Base im Kern des Moleküls enthalten. Dies hätte zu einem Konflikt des gleichzeitigen Vorhandenseins von zwei positiven Ladungen (Na+-Ion und protonierte Schiff-Base) in unmittelbarer Nähe führen müssen. Trotzdem wurde 2013 das erste NaR, KR2, in marinen Bakterien Krokinobacter eikastus gefunden. Die hohe Ionenselektivität von KR2 gegenüber Na+, jedoch nicht gegenüber K+, Ca2+ und H+ macht es zu einem hervorragenden optogenetischen Werkzeug zur potenziellen Stummschaltung. Diese Arbeit widmet sich den strukturellen und funktionellen Studien von KR2. Dieses Rhodopsin ist ein einzigartiger lichtgetriebener Nicht-Protonenkationentransporter. Ein grundlegender Unterschied zwischen KR2 und anderen aktiven Transportern besteht darin, dass es keine Grotthuss- oder Tunnelmechanismen für die Na+-Translokation verwenden kann, die von H+-Pumpen verwendet werden. Außerdem bindet KR2 das transportierte Substrat, ein Na+-Ion, im Ruhezustand nicht. Stattdessen wird Na+ aus dem Zytoplasma aufgenommen und vom Protein während seines Arbeitszyklus, dem sogenannten Photozyklus, in den extrazellulären Raum freigesetzt. Wie bei anderen MRs weist der Photozyklus von KR2 mehrere spektral unterschiedliche metastabile Zwischenzustände auf. Es gibt nämlich K-, L-, M- und O-Zustände. Es wurde gezeigt, dass Na+-Ionen nur im späten O-Intermediat vorübergehend im KR2-Protomer gebunden sind. Diese Tatsache unterstreicht zusätzlich die Existenz eines bemerkenswerten Unterschieds zwischen den Mechanismen des lichtgetriebenen H+- und Nicht-H+-Kationenpumpens. Die Bedeutung der Ergebnisse dieser Arbeit ist vielfältig. Zunächst haben wir die Struktur einer biologisch relevanten pentameren Form von KR2 unter physiologischen Bedingungen bestimmt. Es zeigte die Organisation des Na+-Pumpzustands des NaR. Zweitens haben wir gezeigt, dass die Pentamerisierung des NaR für ein effizientes Na+-Pumpen von entscheidender Bedeutung ist. In der Tat ist die pentamere Anordnung sowohl für die Ionenaufnahme als auch für die Ionenfreisetzung entscheidend, da sie die inneren Hohlräume vom Weltraum aus leichter zugänglich macht. Die Oligomerisierung ist auch ein obligatorischer Faktor für die Organisation des Na+-Pumpzustands von KR2. Drittens erhielten wir eine 2.1 Å-Struktur des O-Zustands des KR2-Photozyklus mit transient gebundenem Na+-Ion im Kern des Proteinprotomers. Viertens beschreiben wir den Na+-Translokationsweg und demonstrierten seine Umlagerungen während des KR2-Photozyklus. Fünftens berichteten wir über Strukturschalter, die der Umwandlung der Na+ -zu-H+-Pumpe bei pH-Abnahme entsprechen. Sechstens ermöglichten diese Ergebnisse den molekularen Mechanismus des lichtgetriebenen Na+-Pumpens vorzuschlagen. Wir haben gezeigt, dass der Mechanismus Prinzipien des passiven Ionentransports durch die Hohlräume des Proteins umfasst, ähnlich wie bei Channelrhodopsinen. Gleichzeitig besitzen NaRs im Gegensatz zu ihnen eine Na+-Bindungsstelle in der Nähe der Schiff Base, deren Existenz eine unidirektionale Translokation von Ionen durch das Protein ermöglicht. Siebtens haben wir die ersten Strukturen der K+-Pumping-KR2-Varianten G263F und S254A gelöst. Die Ergebnisse wurden in 2 Manuskripten in Science Advances (2019) und Nature Communications (2020) veröffentlicht. Daher liefert diese Arbeit Einblicke in die molekularen Mechanismen der Funktion von NaRs und vertieft und erweitert das Verständnis dieses grundlegenden biologischen Prozesses. Die erhaltenen Strukturen eröffnen den Weg für das weitere rationale Design verbesserter optogenetischer Werkzeuge auf KR2-Basis, einschließlich solcher mit modifizierter Ionenselektivität.

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